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關(guān)于固相多肽合成這些雷你都避開了嗎？

發(fā)布時間：2023-08-14 瀏覽量：0

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什么是固相多肽合成？

拿著這個問題問問生科和化學的學生們，哪怕自己沒有操作過，很多人也能回答得差不多。畢竟固相多肽合成的出現(xiàn)，極大地催生了相關(guān)學科的發(fā)展。

現(xiàn)在，一說合成多肽，第一反應(yīng)就是用固相多肽合成技術(shù)，產(chǎn)率佳，純度高，質(zhì)量穩(wěn)定，對環(huán)境友好……這個技術(shù)的優(yōu)勢簡直太多了！

也正是因為固相多肽合成如此“好用”，自1920年多肽藥物胰島素問世以來，多肽藥物就重塑了在現(xiàn)代制藥領(lǐng)域的地位。在過去的20多年里，全球?qū)⒔薪^60種多肽類藥物獲得批準。根據(jù)一項全球多肽行業(yè)的數(shù)據(jù)分析，2016年至2024年多肽治療的年增長率將達到9.1%。多肽行業(yè)的發(fā)展，除了固相多肽合成技術(shù)的進步之外，現(xiàn)實的需求也很強勁，比如代謝疾病和癌癥發(fā)病率持續(xù)增加，需要更多多肽藥物來進行治療。當然，需求大，自然來錢多，最暢銷的治療代謝性疾病的多肽類藥物，例如利拉魯肽(Victoza)和類胰高血糖素肽1(GLP-1)每年至少有20億美元的銷售額^[1]。

咱們今天就來聊聊多肽藥物制備的那些事兒。

多肽藥物制備二三事

多肽泛指2～100個氨基酸經(jīng)肽鍵連接形成的化合物，多肽藥物具有生物活性高，特異性強，副作用小等特點。

從合成角度看，多肽藥物的制備主要有化學合成、基因重組及天然提取三種方法，其中固相化學合成多肽技術(shù)擁有產(chǎn)率佳，純度高，質(zhì)量穩(wěn)定，環(huán)境友好等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于3～50個序列的多肽原料藥生產(chǎn)。

那么厲害的固相多肽合成，了解一下

多肽的化學合成主要通過以下三種反應(yīng)：

(1) 有保護基氨基酸的脫保護反應(yīng)；

(2) 羧基脫保護和氨基酸活化的并行反應(yīng)-生成加入肽鏈的下一氨基酸；

(3) 偶聯(lián)反應(yīng)-形成酰胺鍵并合成最終的多肽。

在反應(yīng)(1)中，原料是有保護基的氨基酸；在反應(yīng)(2)中，需要多種試劑活化氨基酸的羧基。

圖1. 固相多肽合成

無論什么反應(yīng)，起始原料的純度都至關(guān)重要。在多肽固相合成中，原料Fmoc-氨基酸中的雜質(zhì)主要源于Fmoc基團結(jié)合到氨基酸過程中的副反應(yīng)，有以下三類：

二肽雜質(zhì)

這類雜質(zhì)源于在氨基酸上接入Fmoc基團的試劑和已經(jīng)成形的Fmoc-氨基酸發(fā)生副反應(yīng)。二肽雜質(zhì)存在會導(dǎo)致目標氨基酸重復(fù)插接。

圖2 二肽雜質(zhì)

β-丙氨酰類雜質(zhì)

在氨基酸中引入Fmoc基團時，F(xiàn)moc-OSu會發(fā)生開環(huán)和重排，形成β-丙氨酰類雜質(zhì)。此類雜質(zhì)存在會導(dǎo)致另一分子的的β-丙氨酸殘基(B)或β-丙氨酸(A)取代目標氨基酸插接到肽段

圖3 β-丙氨酰類雜質(zhì)

游離氨基酸雜質(zhì)

游離氨基酸源于氨基酸與Fmoc試劑的不完全反應(yīng)。游離氨基酸存在會導(dǎo)致多個目標氨基酸重復(fù)插接肽鏈，導(dǎo)致Fmoc基團在Fmoc-氨基酸衍生物儲存過程中自動催化裂解。

毫無疑問，這些雜質(zhì)都會大大降低固相多肽合成的產(chǎn)率和純度，增大提純難度。

多肽合成中的“隱藏殺手”：乙酸

相比于氨基酸骨架的雜質(zhì)，乙酸則更像是固相多肽合成的“天敵”。由于分子量小且也會被活化劑活化，具有高反應(yīng)活性，即便痕量乙酸也會在固相合成過程中截斷延伸的肽鏈。

有很多人覺得一點點乙酸，無關(guān)緊要。那咱們來做個數(shù)學題：

Fmoc-Arg(Pbf)-OH受到低至0.1%的乙酸污染，就相當于1mol%的乙酸污染。但如果考慮到通常試劑用量會超出5倍，而高反應(yīng)活性乙酸會先于氨基酸與肽段結(jié)合，則每次循環(huán)會造成高達5%的鏈終止。如果合成的多肽含有3%的精氨酸殘基，則意味著15%的鏈會終止。

圖4 乙酸對合成多肽的影響

下圖是實例展示。僅僅0.1%的乙酸污染對于21 mer多肽合成的影響；截斷的副產(chǎn)物采用“*”表示。

圖5 含有乙酸合成多肽的HPLC譜圖

Fmoc-氨基酸中的乙酸很難檢測，默克專門開發(fā)了標準Fmoc-氨基酸中乙酸定量的方法。

跟所有工業(yè)產(chǎn)品一樣，氨基酸原料的純度也存在批次差異。這里有個規(guī)律，純度越高，差異性就越小。

多肽批次間差異

談完原料，可以說說多肽了。

序列相同的多肽，不同批次間存在差異，這個無法避免。序列不同的多肽，本身的性質(zhì)也有差異，比如聚集 – 疏水性多肽的濃度越高，聚集也越高，活性主要取決于聚集形態(tài)下的活性。

此外，穩(wěn)定性也很重要。多肽在儲存過程中會有化學轉(zhuǎn)變。比如含有Asp-Gly的多肽導(dǎo)致形成iso-Asp，多肽中的Cys通過形成二硫鍵而交聯(lián)以及Met氧化成亞砜和焦谷氨酸形成。這些雜質(zhì)有可能帶有細胞毒性，比如二硫蘇糖醇（DTT）。

除了純度之外，多肽的穩(wěn)定性跟儲存有關(guān)，凍干狀態(tài)常比溶液更穩(wěn)定；再一個影響穩(wěn)定性的因素就是氨基酸組成和序列，所謂sequence depends！

下面是幾個典型的組成和序列導(dǎo)致的穩(wěn)定性降低。

水解：含Asp (D)的多肽的常見問題。含有Asp-Pro (D-P)或Asp-Gly (D-G) 組合的多肽容易脫水，形成環(huán)狀亞胺中間體。另外，含有Ser (S) 的序列也可能形成可切割肽鏈的環(huán)狀亞胺中間體。

氧化：Cys (C)和Met (M)殘基是發(fā)生可逆氧化的主要氨基酸。甲硫氨酸殘基發(fā)生氧化后形成甲硫氨酸亞砜和/或甲硫氨酸砜，很難逆轉(zhuǎn)。

二酮哌嗪和焦谷氨酸形成：二酮哌嗪形成通常發(fā)生在甘氨酸(G)位于N末端第3位點時，Pro (P)或Gly (G)位于第1或第2位點時更易發(fā)生。如果Gln (Q)位于序列的N末端位點，則焦谷氨酸形成幾乎是不可避免的。這種轉(zhuǎn)變也可能發(fā)生在N末端位點含有Asn (N)的多肽序列中，但可能性較小。

歸根到底，想要高質(zhì)量的多肽產(chǎn)品，就一定需要高品質(zhì)的原料和試劑。

END

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