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如何確保固相多肽合成（SPPS）中的最佳肽純度和產(chǎn)量

發(fā)布時(shí)間：2023-08-14 瀏覽量：0

固相多肽合成主要指的是將受保護(hù)的氨基酸衍生物連續(xù)添加到生長(zhǎng)的肽鏈中，包括脫保護(hù)和洗滌步驟，以除去未反應(yīng)的基團(tuán)和副產(chǎn)物。如果每一步都是100%完成，那就會(huì)形成一個(gè)全長(zhǎng)的肽，但是這種情況很難發(fā)生，因?yàn)闊o(wú)論合成方案如何優(yōu)化，總是會(huì)存在副反應(yīng)或者反應(yīng)不完全的情況，從而影響肽的純度。因此，提高肽純度是固相多肽合成應(yīng)用中的關(guān)鍵點(diǎn)。

01/

如何測(cè)定肽純度

肽純度的測(cè)量通常使用反向高效液相色譜法（RP-HPLC）和質(zhì)譜法（MS），另外，氨基酸分析也可用于計(jì)算肽的產(chǎn)量或?qū)嶋H量。

02/

不同標(biāo)準(zhǔn)下肽純度的應(yīng)用

固相多肽合成過(guò)程中最常見(jiàn)的雜質(zhì)主要包括以下幾類(lèi)：刪除序列、截?cái)嘈蛄小⒉煌耆摫Ｗo(hù)序列、裂解過(guò)程中修飾的序列（肽上其他位置的保護(hù)基重新附著）、合成過(guò)程中形成的其他副反應(yīng)產(chǎn)物（例如天冬氨酸亞胺形成、氧化產(chǎn)物等）、TFA（三氟乙酸）和乙酸等。

根據(jù)水平的不同，這些雜質(zhì)中的一種或者多種會(huì)對(duì)您的應(yīng)用產(chǎn)生直接影響。例如，特定的階段序列可以干擾研究中的靶向結(jié)合，或者TFA可以殺死生物測(cè)定中使用的細(xì)胞。那么，首先必須對(duì)合成本身進(jìn)行優(yōu)化，以確保正確的分子種類(lèi)被合成達(dá)到足夠高的水平，使合成錯(cuò)誤的、有問(wèn)題的序列降低到非常低的水平。第二要優(yōu)化下游的處理步驟，包括合成后鹽交換的步驟，通常需要對(duì)乙酸鹽進(jìn)行藥物的物質(zhì)和分析測(cè)試。第三還要檢查冷凍干燥的相對(duì)優(yōu)勢(shì)以及與將肽保持在溶液中的穩(wěn)定性測(cè)試等。

2.1

合成不同純度肽的應(yīng)用指南

2.1.1

低純度（>50%）：該水平適用于先導(dǎo)化合物的高通量篩選。如果您正在研究免疫應(yīng)答，除去特定的污染物，>70%可以用于抗原制備。

2.1.2

中等純度（>70%）：該水平足以生產(chǎn)、純化和測(cè)試免疫測(cè)定中使用的抗體、進(jìn)行酶底物研究、表位作圖、親和純化、生物測(cè)定或其他免疫學(xué)應(yīng)用以及肽篩選。生物化學(xué)和半定量應(yīng)用可能需要達(dá)到>85%的純度。例如酶學(xué)、表位作圖或研究生物活性、酶-底物相互作用、磷酸化作用和蛋白質(zhì)印記或細(xì)胞黏附中的肽封閉等。

2.1.3

高濃度（>90%）：該水平適用于定量生物測(cè)定、定量體外受體-配體相互作用研究、配體結(jié)合的生物活性研究、定量阻斷和競(jìng)爭(zhēng)性抑制試驗(yàn)、定量磷酸化和蛋白水解研究、電泳標(biāo)記和色譜標(biāo)準(zhǔn)分析。

2.1.4

極高純度（>98%）：該純度適用于肽作為藥物進(jìn)行體內(nèi)研究、臨床試驗(yàn)、藥物測(cè)試以及結(jié)構(gòu)活性關(guān)系研究。

03/

優(yōu)化合成以達(dá)到所需濃度

實(shí)現(xiàn)特定應(yīng)用所需的純度意味著要最大限度地提高正確偶聯(lián)的效率，并最大限度地減少副反應(yīng)、缺失、外消旋化等。難度可能因肽序列不同而異。長(zhǎng)肽（>30個(gè)氨基酸）和復(fù)合肽在合成時(shí)本身就存在很大挑戰(zhàn)，一些特定區(qū)域（例如環(huán)狀或支鏈殘基）可能在合成過(guò)程中導(dǎo)致聚集，包括疏水性氨基酸或修飾。

3.1

合成前的關(guān)鍵優(yōu)化步驟

3.1.1

序列分析：例如使用軟件在合成之前進(jìn)行合成預(yù)測(cè)，以確定在整個(gè)合成過(guò)程中是否存在合成難度很大的區(qū)域。

3.1.2

副反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估：例如外消旋化。有許多策略可以降低副反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)或有助于提高單個(gè)偶聯(lián)反應(yīng)的效率，包括偽脯氨酸、二肽構(gòu)建塊、添加劑以及替代側(cè)鏈保護(hù)。

3.2

固相多肽合成（SPPS）過(guò)程中關(guān)鍵步驟

3.2.1

樹(shù)脂選擇：SPPS通常在與1%二乙烯基苯（DVB）交聯(lián)的聚苯乙烯上進(jìn)行。替代品包括聚乙二醇（PEG）衍生物，樹(shù)脂的選擇會(huì)影響合成成功率和粗品的純度。連接到柱上的連接物提供生長(zhǎng)肽和固相載體之間的可逆連接，并確定最終產(chǎn)物的性質(zhì)和可使用的化學(xué)性質(zhì)。接頭的選擇決定了最終產(chǎn)物中的C端官能團(tuán)。

3.2.2

偶聯(lián)化學(xué)：選擇通常取決于合成速度，較快的合成需要比較慢的合成（DIC、HBTU）更高反應(yīng)性（=不穩(wěn)定）的偶聯(lián)試劑（HCTU、HATU和COMU）。反應(yīng)溫度會(huì)影響偶聯(lián)化學(xué)的選擇。

3.2.3

反應(yīng)溫度：提高溫度可能會(huì)加快合成并提高純度，但并不總是如此。需要注意的是，基于微波的加熱只是加熱，微波本身對(duì)合成沒(méi)有特殊影響。

3.2.4

監(jiān)控脫保護(hù)：能夠通過(guò)實(shí)時(shí)紫外監(jiān)測(cè)來(lái)監(jiān)控，例如脫保護(hù)步驟的效率對(duì)于優(yōu)化是非常重要的。

3.2.5

雙重耦合：預(yù)測(cè)軟件確定的困難耦合可以通過(guò)雙重耦合、延長(zhǎng)耦合時(shí)間或添加更多等效物來(lái)處理。

3.2.6

空間位阻：偶聯(lián)試劑必須足夠快速，以便可以引入空間位阻氨基酸。

3.2.7

封端：這樣做是為了在偶聯(lián)反應(yīng)后永久阻斷任何未反應(yīng)的氨基，或使完整肽的N-末端乙酰化。它對(duì)于在合成困難或長(zhǎng)肽期間最小化缺失產(chǎn)物和輔助純化過(guò)程是有很用的。